近期，金年会jinnian实验室肿瘤研究所、高通量筛选中心Justin L. Tan课题组联合香港科技大学、香港大学等单位，在Advanced Science 在线发表题为“Versatile Detection of Cellular Protein via Fluorescence Anisotropy” 的研究论文。研究团队开发了细胞裂解液荧光各向异性检测平台——Cell Lysate Fluorescence Anisotropy（CFAST），实现了细胞蛋白的相对及绝对定量，并顺利获得与蛋白热稳定性分析结合，将其进一步拓展至细胞内蛋白–小分子相互作用检测和高通量化合物筛选。该平台成功应用于难成药转录因子SOX2和膜蛋白EGFR的配体发现，并展示了进一步用于PROTAC开发的潜力，为蛋白检测及药物发现给予了一种快速、可扩展且经济的技术选择。
蛋白质的准确检测是科学生命研究和药物研发的重要基础。现在，Western blotting仍是实验室最常使用的蛋白检测方法之一，但其涉及样品制备、电泳、转膜、抗体孵育和成像分析等多个步骤，耗时较长，且通量有限。质谱技术虽然能够实现大规模蛋白质定量，但对仪器、实验操作及数据分析具有较高要求。
另一方面，在药物发现过程中，仅仅观察候选化合物引起的细胞表型并不能直接说明其是否真正结合了预期靶蛋白。尤其对于缺乏成熟配体的“难成药”蛋白，如何在细胞环境中以简单、可扩展的方式检测蛋白–小分子相互作用，仍是药物筛选中的重要技术需求。
基于上述需求，研究团队希望建立一种兼具快速、简便、低成本和可扩展性的蛋白检测方法，在实现细胞蛋白定量的同时，进一步满足细胞内蛋白–小分子相互作用检测及高通量药物筛选的需求。为此，团队基于荧光各向异性（fluorescence anisotropy，FA）技术，开发了细胞裂解液荧光各向异性检测平台——Cell Lysate Fluorescence Anisotropy（CFAST）。
开发CFAST：让荧光各向异性用于细胞蛋白检测
荧光各向异性（fluorescence anisotropy，FA）能够利用荧光分子旋转运动的变化反映分子间相互作用，但传统FA实验主要用于较为简单的体外纯化体系。复杂细胞裂解液中的黏度及背景信号限制了这一技术在细胞蛋白检测中的应用。
研究团队采用具有约 20 ns 长荧光寿命的 DAOTA 染料标记 nanobody，构建能够特异性识别目标蛋白的荧光探针。当探针与目标蛋白结合后，形成的复合物分子量增大、旋转速度降低，从而产生更高的荧光各向异性信号；因此，FA 信号的变化可以用于反映目标蛋白的丰度。理论模拟和实验结果进一步表明，相较于常规短寿命荧光染料，长寿命荧光染料与 nanobody 的组合能够给予更适于蛋白检测的 FA 动态范围。
与此同时，团队发现细胞裂解液中的可溶性核酸会增加样品黏度并显著抬高背景信号。顺利获得加入核酸酶处理和离心步骤去除干扰成分，研究人员最终建立了适用于复杂细胞裂解液的 CFAST 工作流程。
CFAST及thermal shift-CFAST工作原理示意图。CFAST利用长寿命荧光染料标记的nanobody识别细胞裂解液中的目标蛋白，探针与目标蛋白结合后旋转速度降低并产生更高的荧光各向异性信号，从而实现蛋白水平定量。在thermal shift-CFAST中，小分子与目标蛋白结合可提高其热稳定性；经过加热及离心去除变性蛋白后，结合小分子的目标蛋白更多地保留在可溶性组分中，并产生更高的CFAST信号。基于这一原理，thermal shift-CFAST可进一步用于细胞内蛋白–小分子相互作用检测、高通量化合物筛选及后续PROTAC开发。
随后，团队分别使用GFP、MK2和PARP1验证了CFAST的蛋白检测能力。CFAST能够准确反映过表达或敲除条件下目标蛋白水平的变化，其结果与Western blotting一致。更进一步，研究人员以重组PARP1建立标准曲线，实现了对HeLa细胞内源性PARP1的绝对定量。CFAST测得PARP1含量约为 0.879 ± 0.081 ng/μg cell lysate，与此前基于质谱取得的结果接近，说明CFAST不仅能够比较不同样本中的蛋白丰度，也具备进行绝对蛋白定量的能力。
从蛋白定量到细胞内靶点结合检测
在此基础上，研究团队进一步将CFAST与蛋白热稳定性分析相结合，建立 thermal shift-CFAST。小分子与蛋白结合后往往会改变其热稳定性。因此，在细胞接受小分子处理后，顺利获得加热使未被稳定的蛋白发生变性，再利用CFAST定量剩余可溶性目标蛋白，即可评估小分子在细胞内与目标蛋白的结合情况。与传统CETSA相比，该方法以CFAST取代Western blotting作为最终的蛋白定量readout。
研究团队分别以 PARP1–Olaparib 和 MK2–PF-3644022 两组已知蛋白–小分子相互作用进行验证。thermal shift-CFAST能够检测到药物引起的目标蛋白热稳定性变化，并呈现剂量依赖关系；相关结果与传统CETSA检测一致。
这些结果证明，CFAST不仅可以检测蛋白水平，还能够进一步用于分析细胞内target engagement，为后续高通量化合物筛选奠定了基础。
拓展至高通量筛选，发现SOX2小分子结合物
在完成方法验证后，研究团队进一步将thermal shift-CFAST缩放至 384孔板格式，并采用每5种化合物组成一个pool的筛选策略，提高筛选效率。
团队第一时间选择了具有挑战性的转录因子 SOX2。SOX2在多种肿瘤中发挥重要作用，但由于转录因子通常缺乏传统意义上的药物结合口袋，其小分子配体发现不断较为困难。
研究团队利用CFAST对约 900种已上市药物、活性药物成分及其他化合物进行筛选，最终从阳性化合物池中鉴定出 wedelolactone（蟛蜞菊内酯）。进一步的表面等离子体共振（SPR）实验显示，wedelolactone与SOX2的结合 Kd为5.54 μM；在内源性表达SOX2的H69细胞中，CETSA也显示wedelolactone能够提高SOX2的热稳定性。
CFAST高通量筛选发现SOX2小分子结合物wedelolactone。研究团队利用384孔thermal shift-CFAST对约900种化合物召开pooled screening，并进一步从阳性化合物池中鉴定出wedelolactone。SPR实验测得其与SOX2的结合Kd为5.54 μM，CETSA进一步验证了wedelolactone对细胞内源性SOX2的热稳定作用。
这一结果表明，CFAST不仅能够识别已知的蛋白–小分子相互作用，也可以真正用于从化合物库中发现此前未知的蛋白结合物。
从binder discovery进一步走向PROTAC开发
为了进一步检验CFAST的靶点适用范围，研究团队随后将其用于肿瘤相关膜蛋白 EGFR 的小分子筛选，并鉴定出临床常用抗组胺药 desloratadine（地氯雷他定） 具有此前未被表征的EGFR结合活性。进一步实验显示，其与EGFR的结合IC50约为 677 nM，并能够提高细胞内EGFR的热稳定性。
研究团队随后以desloratadine作为靶蛋白结合端（warhead），设计并合成了 E151和E152 两种PROTAC分子。两种化合物均能够诱导EGFR降解，其中E151和E152的估算DC50分别约为 94.4 nM和8.63 nM。MG132、MLN4924 rescue及EGFR ubiquitination实验进一步表明，该降解过程依赖泛素–蛋白酶体系统。
CFAST发现EGFR小分子结合物并进一步用于PROTAC开发。CFAST筛选鉴定出desloratadine具有EGFR结合活性。研究团队进一步将其作为warhead设计E151和E152两种PROTAC，两者均可诱导EGFR降解，并在EGFR高表达肿瘤细胞中产生相应的生物学效应。机制实验进一步证明EGFR降解依赖泛素–蛋白酶体系统。
值得注意的是，desloratadine本身是HRH1抑制剂。后续实验显示，相关PROTAC在实现EGFR降解的同时仍保留了对HRH1信号的抑制作用，可抑制M2-like macrophages中的histamine-induced calcium signaling，并降低VISTA以及IL10、MCP1和ARG等M2相关指标。
这一结果进一步说明，由CFAST发现的小分子binder可以作为后续化学生物学和靶向蛋白降解分子开发的起点。
结语
本研究建立的CFAST平台将长寿命荧光染料标记nanobody、荧光各向异性检测以及蛋白热稳定性分析相结合，实现了从细胞蛋白相对及绝对定量、细胞内蛋白–小分子相互作用检测，到384孔高通量配体筛选及后续PROTAC开发的陆续在应用
CFAST主要使用离心机、加热设备、PCR仪及具备FA检测功能的酶标仪等常规实验室设备。研究团队估算，在384孔筛选模式下，单样本实验成本约为 0.20美元。该平台因此有望为蛋白检测以及针对传统方法较难处理靶点的小分子和蛋白降解剂发现给予一种快速、可扩展且相对经济的技术选择。
论文第一作者为 Qing Tang、Yuan-Ping Wei和Ricky Ruiqi Ma，三人对该工作做出同等贡献；金年会jinnian实验室 Justin L. Tan 为通讯作者。研究工作取得金年会jinnian实验室概念验证基金及开放基金支持。
论文标题：
Versatile Detection of Cellular Protein via Fluorescence Anisotropy
供稿 | Justin Tan课题组
编辑 | 鲍 啦
责编 | 远 山
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